Lázaro Gonçalves Cuinica

 

Lecturer (Universidade Pedagógica de Moçambique – Delegação de Nampula)

PhD Student in Pharmacochemistry (Instituto de Pesquisa de Fármacos e Medicamentos/ Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, UFPB – Brasil)
MSc in Toxicology (Institute of Biomedical Sciences/University of Porto - Portugal)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondência: Lázaro Gonçalves Cuinica

                E-mail: lcuinica2010@gmail.com  

 

 

 

RESUMO

O stress oxidativo é uma irregularidade fisiológica considerada uma das responsáveis pelo envelhecimento do organismo humano e fator de risco para diversas doenças na maioria dos mamíferos. Nesta pesquisa avaliou-se os efeitos do stress oxidativo induzido por peróxido de hidrogénio (H₂O₂) e menadiona em células de Mus musculus. Constatou-se que 5 mM do H₂O₂ e da menadiona induziram alta redução da actividade enzimática de superóxido dismutase e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, e elevou a taxa de carbonilação de proteínas.

 

Palavras-chave: Stress oxidativo, Espécies reactivas de oxigênio, H₂O₂ e Menadiona

 

ABSTRACT

 

Oxidative stress is a physiological irregularity, which is regarded to be one of the responsible for the human aging, as well as a risk factor for many diseases in most mammals. This study evaluated the effects of the oxidative stress induced by hydrogen peroxide (H₂O₂) and menadione in Mus musculus cells. The findings show that 5 mM of H₂O₂ and menadione reduced the enzymatic activity of superoxide dismutase and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Furthermore, the rate of carbonylation protein increased

Keywords: Oxidative stress, Reactive oxygen species, H₂O₂ and Menadione

 

 

INTRODUÇÃO

 

O oxigénio (O₂) é essencial para a vida, mas pode apresentar um carácter tóxico (Barreiros e David, 2006). Os organismos dependem do O₂ para as reacções de oxidação nas vias de formação de trifosfato de adenosina (ATP - Adenosine triphosphate), destoxificação e biossíntese (Barreiros e David, 2006). Porém, quando o O₂ actua como um receptor de electrões, em diversos processos enzimáticos e não enzimáticos, é transformado em radicais livres de oxigénio, tais como o anião superóxido (O₂^.), peróxido de hidrogénio (H₂O₂) e radical hidroxilo (OH^.), espécies químicas bastante reactivos e tóxicos (De-Groot, 1994; Fridovich, 1997; Halliwell e Whiteman, 2004). A principal fonte de produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS - Reactive Oxygen Species) é a respiração mitocondrial (Toykuni, 1999). Outras fontes endógenas incluem o metabolismo por acção das oxirredutases, e as exógenas incluem principalmente o fumo do cigarro, poluentes atmosféricos, aditivos e conservantes alimentares (Klings e Farber, 2001). A presença de ROS nos processos metabólicos ou na cadeia respiratória pode conduzir a diversos danos na célula, como proxidação lipídica carbonilação de proteínas e danos oxidativos no DNA, contribuindo para o envelhecimento, morte celular e aparecimento de doenças degenerativas (Nakazawa et al., 1996; Mccord, 1998). Os principais agentes causadores de stress oxidativo são os radicais OH^., uma vez que um aumento dos níveis de radicais superóxido, H₂O₂ ou iões metálicos de actividade redox (Cu e Fe) está associado à produção de altos níveis de radicais OH^. (Breitenbach e Eckl, 2015).

            O peróxido de hidrogénio (H₂O₂) resulta da reacção de destoxificação do anião superóxido (O₂^.) pela enzima superóxido dismutase (SOD) (Sies, 1995). Apesar de não ser um radical de O₂, o seu potencial de toxicidade está associado à fácil redução deste composto a radicais OH^., pela reacção de Fenton, ou pela reacção de Haber-Weisss (Sies, 1995; LANE, 2011).

A menadiona constitui uma quinona, podendo contribuir para o aumento da produção de ROS. As quinonas podem ser reduzidas a semi-quinonas, complexos muito instáveis e reactivos que reagem com o O₂, regenerando a quinona e reduzindo-o a anião superóxido (O₂^.) (Criddle et al, 2006). Este, por sua vez, pode ser convertido a H₂O₂ ou OH^.. O H₂O₂ uma vez formado deve ser reduzido a H₂O para prevenir a formação do radical OH^.. A catalase destrói o H₂O₂ tal como moléculas da família das peroxidases, encontrando-se presente ao nível dos peroxisomas e em menor quantidade no citosol e nos microsomas da célula (Criddle et al, 2006).

            Sob condições fisiológicas normais, os danos celulares são prevenidos por defesas antioxidantes celulares que destroem as ROS (defesas primárias) e pela reparação de danos moleculares ou degradação de moléculas oxidadas (defesas secundárias) (Halliwell, 1990; Davies, 2000). Porém, sob certas condições de stress, os níveis de ROS excedem a capacidade antioxidante da célula, provocando situações de stress oxidativo. Este desequilíbrio pode resultar de uma diminuição de antioxidantes, por diminuição da sua disponibilidade, e/ou de um aumento da produção de ROS. Para a destoxificação ou redução de altos níveis das ROS participam várias enzimas como a superóxido dismutase (SOD), catalase e a glutationa (Sies, 1986; Halliwell, 1999; Davies, 2000).

Na cadeia respiratória, o anião superóxido (O₂^.) é produzido ao nível do complexo I e III, presentes na membrana mitocondrial (Rahman et al., 2012). A SOD constitui uma das enzimas de defesa primária e catalisa a conversão do anião superóxido (O₂^.) em H₂O₂, o qual não é tóxico, mas poderá ser convertido a outras ROS na célula (Poljsak e Milisav, 2013). Nos eucariotas esta enzima existe sob três isoformas: CuZnSOD, MnSOD e SOD extracelular. A enzima CuZnSOD é a mais abundante, estando presente em 90% das células, no citosol e no espaço intermembranar, enquanto que a enzima MnSOD está presente na membrana mitocondrial (Poljsak e Milisav, 2013).

            A enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) catalisa a conversão de gliceraldeído 3-fosfato na reacção da glicólise, degradando a glicose em glicerol e piruvato e resultando na formação de NADH (Temple et al., 2005). Em condições de stress oxidativo, esta enzima é rapidamente inactivada e a degradação da glicose vai ser realizada pela via das pentoses fosfato, ocorrendo a formação de NADPH em vez de NADH (Temple et al., 2005). O facto de se produzir NADPH em situações de stress oxidativo é vantajoso para a célula porque vai ser utilizado na redução de glutationa dissulfito (GSSH) à glutationa reduzida (GSH), pela enzima glutationa redutase (GR). A glutationa é uma das principais defesas do organismo para protecção contra o stress oxidativo e pode actuar em vários processos celulares de destoxificação, como é o caso da redução do H₂O₂ (Mannervik, 1985). Nesta reacção, catalisada pela glutationa peroxidase (GPx), o grupo reactivo sulfidrilo da glutationa reduz o H₂O₂ em H₂O e os peróxidos lipídicos a álcoois não tóxicos, pela oxidação de duas moléculas de glutationa e formação de uma molécula de glutationa dissulfito (Gaetani, 1989).

Várias modificações proteicas ocorrem devido à oxidação de cofactores 4Fe-4S (centros activos de muitas enzimas) e de aminoácidos contendo enxofre, ligações entre resíduos de tirosina, interconversão de aminoácidos, formação de aductos com produtos resultantes da peroxidação de lípidos e a carbonilação de proteínas (Yu, 1994). A formação de grupos carbonilo na proteína resulta da oxidação irreversível de aminoácidos específicos (lisina, prolina, histidina e arginina) e pode ser quantificada por ensaios espectofotométricos ou por ensaios imunológicos (Yu, 1994). Nesta pesquisa avaliam-se os efeitos do stress oxidativo induzido por H₂O₂ e menadiona em células de Mus musculus.

 

MATERIAIS E MÉTODOS

            Células de Mus musculus, inoculadas em meio de cultura YPD, foram submetidas a diferentes condições de stress durante 60 minutos, na fase exponencial de crescimento. Nesta actividade laboratorial foram usadas 5 amostras (Tabela 1), tendo sido usadas concentrações de 0,5 mM (dose sub-letal) e 5 mM (dose letal) dos oxidantes Menadiona e H₂O₂.

Tabela 1. Condições de stress oxidativo em que as células de Mus musculus foram submetidas

 

Amostra	Oxidante	Concentração (mM)
1	Controlo	0
2	Menadiona	0,5
3	Menadiona	5
4	H2O2	0,5
5	H2O2	5

 

 

Determinação da Concentração de Proteínas

Após tratamento das células com as diferentes condições de stress, os níveis de proteína foram determinados usando o método de Lowry, o qual se baseia na formação de um complexo de cobre-proteína e na redução do regente de Folin-Ciocalteau pelos resíduos de tirosina e triptofano das proteínas, resultando num composto com absorção máxima em 750 nm.

 

Tabela 2. Concentração de proteínas nas amostras

 

Amostra	1	2	3	4	5	BSA P0	BSA P1	BSA P2	BSA P3
Abs705	0,216	0,193	0,195	0,187	0,155	-	0,110	0,209	0,297
Proteína (µg)	42,1	37,5	37,9	36,3	29,9	0	20	40	60
Volume (µl)	4	4	4	4	4	-	40	80	120
Proteína (mg/ml)	10,50	9,37	9,47	9,08	7,47	-	-	-	-

 

A concentração de proteínas das amostras ilustrada na Tabela2 foi determinada pela equação da recta padrão: y = 0,005x + 0,0055 em 750 nm de absorvância, a 0,5 mg/ml de albumina de soro bovino (BSA) correspondente a 20 - 60 µg de BSA.

Análise da actividade da Superóxido dismutase

A actividade de Superóxido dismutase (SOD) foi detectada in situ após a separação das proteínas em gel de poliacrilamida nativo. Nestas condições, as proteínas não são desnaturadas e a sua separação é feita em função da massa molecular e da carga. A riboflavina reduz fotoquimicamente o O₂ ao radical superóxido (O₂^.), o qual reduz o NBT²⁺ (amarelo) a formazan (roxo). Se a SOD estiver presente, ela intercepta o O₂^., impedindo a formação de formazan, o que origina o aparecimento de bandas acromáticas contra um fundo azul.

Após a electroforese das amostras em géis de poliacrilamida e a incubação em NBT, estes foram transferidos para uma solução de desenvolvimento, na presença ou ausência de cianeto (KCN). O cianeto actua como um inibidor da CuZnSOD, pelo que o gel tratado com cianeto apenas evidenciará a presença de MnSOD. Esta técnica possibilita, assim, o estudo da actividade individual de MnSOD e de CuZnSOD, por comparação com a actividade total da enzima superóxido dismutase, na ausência de cianeto.

Análise da actividade da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

Em condições de stress oxidativo, a enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) é rapidamente inactivada e a degradação da glicose vai ser realizada pela via das pentoses fosfato, ocorrendo a formação de NADPH em vez de NADH. Assim, a actividade desta enzima em condições de stress oxidativo, foi avaliada seguindo a formação de NADH a 340 nm. Os valores para cada tratamento foram normalizados em relação ao valor obtido para o respectivo controlo.

Carbonilação de proteínas

As amostras foram tratadas com dinitrofenil-hidrazina (DNPH), o qual reage com os grupos carbonilo presentes nas proteínas e é reduzido a dinitrofenol (DNP). As amostras foram transferidas para uma membrana de PVDF, a qual foi incubada com um anticorpo primário anti-DNP de coelho que se ligou ao DNP presente nas proteínas, e a detecção de grupos carbonilos foi por quimioluminiscência. As bandas das amostras na membrana de PVDF foram quantificadas por densitometria e os resultados foram normalizados em relação ao valor obtido para o respectivo grupo controlo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

 

Análise da actividade da superóxido dismutase

As bandas obtidas pela electroforese das amostras no gel de poliacrilamida sem cianeto (Figura 1) foram quantificadas por densitometria e resultados foram normalizados em relação ao respectivo controlo (Figura 2).

 

Figura 1. Electroforese em gel de poliacrilamida (7,5% acrilamida) das amostras proteicas. Amostra 1 (poço 1 e 4), Amostra 2 (poço 2), Amostra 3 (poço 3), Amostra 4 (poço 5) e Amostra 5 (poço 6).

                                                                                        

Na figura 1, a banda correspondente à enzima MnSOD encontra-se pouco nítida, evidenciando a reduzida actividade desta enzima nestas células, na ausência ou presença de stress oxidativo.

Pela análise dos resultados normalizados evidenciados na figura 2, verifica-se um aumento da actividade da enzima SOD quando as células são tratadas com uma concentração sub-letal de menadiona, comparativamente ao controlo. O tratamento das células com uma concentração letal de menadiona resulta numa diminuição da actividade da SOD em relação ao controlo. Esta situação está de acordo com o esperado, indicando que quando as células são sujeitas a um aumento dos níveis de oxidantes exibem uma adaptação, resultando num aumento da actividade das defesas antioxidantes. Porém, na presença de concentrações letais, as condições de stress oxidativo induzem uma inibição dos mecanismos celulares, provocando uma diminuição da actividade da SOD.

Ao contrário do esperado, concentrações sub-letais de H₂O₂ não resultaram num aumento da actividade da SOD, face ao controlo. Apesar de este oxidante não induzir directamente a actividade da enzima SOD, outros mecanismos moleculares desencadeados pela presença deste oxidante acabam por induzir o aumento da actividade da enzima, o que não é constatado nos resultados obtidos. Tal como anteriormente verificado, o tratamento das células com doses letais de H₂O₂ resultou numa diminuição da actividade da enzima SOD.

A diminuição da actividade da enzima CuZnSOD para concentrações letais está relacionada com a oxidação dos seus centros activos, ocorrendo a libertação de cobre, o qual pode reduzir o H₂O₂ em radical hidroxilo, mais tóxico, pela reacção de Fenton.

Figura 2. Actividade da Superóxido dismutase (SOD) para as diferentes amostras, em relação ao respectivo grupo controlo usado. Amostra 1 (1 e 1’)), Amostra 2 (2), Amostra 3 (3), Amostra 4 (4) e Amostra 5 (5).

 

Análise da actividade da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

Na Tabela 4 são apresentados os resultados da actividade enzimática de GAPDH para os diversos tratamentos. Os valores para cada tratamento foram normalizados em relação ao valor obtido para o respectivo controlo (Figura 3).

Segundo os resultados obtidos, concentrações reduzidas de menadiona não parecem induzir efeitos significativos na actividade enzimática de GAPDH, uma vez que as amostras tratadas com menadiona a 0,5 mM apresentaram uma actividade enzimática semelhante ao verificado no grupo controlo. Este resultado sugere que a esta concentração o sistema antioxidante das células de Mus musculus consegue actuar contra o stress oxidativo induzido pela menadiona, como verificado anteriormente com o aumento da actividade enzimática da SOD a esta concentração. Porém, uma concentração de menadiona de 5 mM resultou numa diminuição significativa da actividade enzimática de GAPDH.

 

	Figura 3. Actividade da enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) para as diferentes amostras, em relação ao respectivo grupo controlo usado. Amostra 1 (1 e 1’), Amostra 2 (2), Amostra 3 (3), Amostra 4 (4) e Amostra 5 (5).

 

 

 

Tabela 4. Actividade da enzima GAPDH nas diferentes amostras analisadas.

Actividade de GAPDH (U mg/Proteína)
	Amostra	G1		G4			Fórmula de cálculo
Controlo G4	1	-	-	2 × 10-7	1
Menadiona	2	1,97 × 10-7	1,05	-	-
	3	0,5 × 10-7	0,27	-	-
H2O2	4	-	-	1,8 × 10-7	0,90		Normalização
	5	-	-	0,64 × 10-7	0,32
Controlo G1	1´	1,88 × 10-7	1	-	-
Act. = actividade enzimática ε340 = 6.3 mM-1 cm-1 Ca = concentração de Proteína (μg/μl) Va = volume da amostra (μl) Vt = volume total (L) TCF = 1.46

 

A actividade da enzima GAPDH nas amostras tratadas com H₂O₂ a 0,5 mM sofreu uma pequena redução relativamente ao verificado no grupo controlo. O tratamento com 5 mM do mesmo oxidante resultou numa diminuição significativa da actividade da enzima. Os resultados obtidos para a actividade da enzima GAPDH em situações de stress oxidativo comprovam a sensibilidade desta enzima à acção tóxica dos oxidantes.

Carbonilação de proteínas

As bandas das amostras na membrana de PVDF (Figura 4) foram quantificadas por densitometria e os resultados foram normalizados em relação ao valor obtido para o respectivo grupo controlo (Figura 5)

Figura 4. Imuno-blot das diferentes amostras para detecção de grupos carbonilo resultantes da oxidação de proteínas. Amostra 1 (1 e 1’), Amostra 2 (2), Amostra (3), Amostra 4 (4), Amostra 5 (5).

 

Segundo os resultados obtidos, concentrações sub-letais de menadiona não induzem efeitos significativos na oxidação de proteínas, uma vez que se registou apenas um ligeiro aumento da carbonilação proteica, relativamente ao controlo. No entanto, os efeitos oxidativos da menadiona em concentrações letais resultam em danos significativos nas proteínas, verificando-se uma elevada taxa de carbonilação. Este resultado evidencia o poder oxidante da menadiona. Relativamente ao Peróxido de Hidrogénio (H₂O₂), doses sub-letais deste oxidante resultaram num aumento da carbonilação proteica, mas o tratamento das células com doses letais deste oxidante evidenciaram uma diminuição da carbonilação. Este facto mostra uma pequena contrariedade com o esperado, pois, o tratamento das células com concentrações crescentes de oxidantes deveria reflectir-se num aumento sucessivo da taxa de carbonilação proteica, de acordo com o efeito dose-resposta.

 

 

Figura 5. Taxa de carbonilação proteica para as diferentes amostras, em relação ao respectivo grupo controlo usado. Amostra 1 (1 e 1’), Amostra 2 (2), Amostra 3 (3), Amostra 4 (4) e Amostra 5 (5).

 

 

 

CONCLUSÃO 

O stress oxidativo induzido por peróxido de hidrogénio e menadiona em células de Mus musculus causa alta redução da atividade de alguns sistemas de defesa antioxidante enzimáticos, o superóxido dismutase (SOD) e o gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), como também aumenta a taxa de carbonilação de proteínas.

 

 

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

                                   

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